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生物素化的NHS能够简单有效的对溶液中的抗体、蛋白质和其他含伯胺的大分子进行生物素标记。不同的生物素化NHS仅在间隔臂长度方面不同，为研究人员提供了优化标记和检测实验的可能性，其中生物素结合的空间位阻是重要因素。

细胞表面生物素化已经成为研究受体和转运蛋白的表达和调节，局限于细胞器膜的蛋白的质膜分化以及膜蛋白在极化上皮细胞中的分布的重要工具。NHS-LC-Biotin(货号：GS4322)不容易渗透细胞膜，常用于特异性标记细胞表面。相比之下，NHS-Biotin(货号：GS4319)是膜可渗透的，能够用于完整细胞内蛋白质的生物素标记。

NHS活化的生物素与pH7～9缓冲液中的伯氨基(-NH2)能够有效反应，形成稳定的酰胺键。包括抗体在内的蛋白质，通常在赖氨酸(K)残基的侧链中具有几个伯胺，并且每条多肽的N末端可以作为NHS活化的生物素试剂进行标记的靶标。两种NHS-生物素试剂不能直接溶于水，必须溶解在有机溶剂如DMSO或DMF中，然后在标记反应中以终浓度加入水溶液中。

图1．NHS-LC-Biotin与伯胺反应的原理图。


生物素是一种小的天然存在的维生素，以高亲和力结合抗生物素蛋白和链霉亲和素蛋白。因为它的分子量很小(244Da)，所有生物素可以与很多蛋白结合而不影响它们的生物活性。标记的蛋白质可以使用固定的链霉亲和素和抗生物素蛋白从未标记的蛋白质中纯化，并且可以用链霉亲和素或亲和素缀合的探针在ELISA，dot blot或Western blot应用中检测。

货号	组分	规格
GS4319	NHS-Biotin	50mg	250mg
GS4322	NHS-LC-Biotin	50mg	-

保存：4℃


NHS-Biotin，N-hydroxysuccinimidobiotin

货号	GS4319
分子量	341.38
间隔臂	13.5 Å
净增加质量	226.08
结构式

NHS-LC-Biotin，succinimidyl-6-(biotinamido)hexanoate

货号	GS4322
分子量	454.54
间隔臂	22.4 Å
净增加质量	339.16
结构式

• 水溶性有机溶剂如二甲基亚砜(DMSO)或二甲基甲酰胺(DMF)。
  
• pH值为7～8的磷酸盐缓冲液(PBS)或其他无胺缓冲液，用作反应缓冲液。
  
• 进行缓冲液交换的脱盐柱或透析装置。

• NHS-生物素试剂对湿度敏感，为了避免产品中的水分冷凝，开瓶前必须先平衡至室温。
  
• 按照说明书方法，试剂在使用前立即溶解。NHS-酯部分易水解并无活性，因此不要制备用于储存的储备溶液，实验前配制，弃掉所有未使用，重构的试剂溶液。
  
• 避免使用含有胺(如Tris和甘氨酸)的缓冲液，因为胺对反应有竞争性(参见图1)。如有必要，透析或用其他脱盐方式，将蛋白质样品的缓冲液交换为无胺体系，如磷酸盐缓冲液(PBS)。
  
• 在溶液中生物素化蛋白质时，过量未反应的生物素和反应副产物可以很简单的通过脱盐柱或透析去除。1～10mg约0.5～2mL的生物素化蛋白质适合用10mL脱盐柱。对于较小质量的蛋白或反应体积，生物素反应和后续的缓冲液交换都可以在单个透析管中进行。若需要处理大体积反应物，则将样品分成两个脱盐柱处理或使用合适的透析管进行缓冲液交换。

一、生物素化蛋白质的方法
以下方法能使每个蛋白质分子掺入3～5个生物素分子。作为大蛋白的抗体，通常会在每个IgG分子中标记8～12个生物素分子，特别是使用更多摩尔过量的生物素试剂时，标记的分子越多。可以调节生物素试剂与蛋白质的摩尔比，获得所需的掺入水平。

• 计算生物素用量
  生物素标记的掺入程度取决于待标记的蛋白质的量及其浓度。通过调节生物素与蛋白质的摩尔比，可以控制标记的掺入水平。与浓缩蛋白质溶液相比，用稀释后的蛋白质溶液进行标记，反应需要更大倍数摩尔比的生物素试剂才能达到相同的结果。通常为了获得最佳效果，使用20倍摩尔过量的生物素试剂来标记2mg/mL蛋白质溶液或使用12倍摩尔过量的生物素试剂来标记10mg/mL蛋白质溶液。
  
  • 计算使用20倍过量摩尔浓度添加到反应中的生物素浓度(mM)
    

    mL protein×	mg protein	×	mmol protein	×	20mmol Biotion	＝mmol Biotin
    	mL protein		mg protein		mmol protein

  • 在步骤B.3中计算10mM生物素试剂添加量：
    

    mmol Biotin×	10×106 μL	×	L	＝μL Biotin
    	L		10mmol

• 生物素标记反应
  
  • 从冷藏室里取出生物素试剂，在步骤3打开之前将其平衡至室温。
    
  • 按照A部分的计算用PBS制备蛋白质溶液：将1～10mg蛋白质溶于0.5～2.0mL PBS。
    
    • 已经溶解在pH7.2～8.0的无胺缓冲液中的蛋白质可以不用进行缓冲液交换或用PBS稀释，直接使用。若溶于Tris或其他含胺缓冲液中的蛋白质，必须交换到合适的缓冲液中才能使用。
  • 使用前在二甲基亚砜(DMSO)或二甲基甲酰胺(DMF)等有机溶剂中制备10mM生物素试剂溶液。
    
    • NHS-Biotin：2.0mg溶于590μL溶剂。
      
    • NHS-LC-Biotin：2.3mg溶于500μL溶剂。
  • 加入适量(见A部分计算)10mM生物素试剂溶液到蛋白溶液中。
    
  • 冰上孵育2小时或室温孵育30分钟。
    
    • 除了一般蛋白质的降解或微生物生长的可能性外，反应时间长于指定时间没有任何损害。
  • 此时蛋白质标记完成，虽然过量的未反应物质和水解的生物素试剂残留在溶液中，但通常可以通过ELISA或Western印迹进行标记蛋白的初步测试。一旦确定蛋白质的功能正常和标记成功，为了获得蛋白质最佳的性能和稳定性，可以使用脱盐柱或透析来纯化标记的蛋白质。如果用生物素定量试剂盒(HABA测定)来确定生物素掺入的水平，蛋白质必须先经过脱盐或透析除去未反应的生物素。

二、生物素化细胞的方法
文献中提到这种方法存在许多变化，Sulfo-NHS-生物素试剂不容易渗透细胞膜，通常用于特异性标记细胞表面。相比之下，NHS-生物素试剂是膜可渗透的，能够用于完整细胞内蛋白质的生物素标记。

标记可以在细胞悬浮液上或在培养板中的贴壁细胞上进行。在后者情况下，NHS-生物素向细胞的所有表面扩散会受到限制，并且标记将主要发生在暴露的细胞表面上。另外必须将细胞中的培养基成分洗涤干净，否则其中的含胺组分会与细胞表面蛋白竞争并淬灭反应。使用浓缩的细胞悬浮液是最有效的，因为反应中只需要较少的生物素试剂。通常，终浓度为2～5mM的生物素试剂是有效的。NHS的反应速度随pH的增加而增加，因此，下述实例中pH8.0，使其能尽快地完成标记。

• 用预冷的PBS(pH8.0)洗涤细胞三次，从细胞中除去含胺的培养基和蛋白质
  
• 在PBS(pH8.0)中，以约25×10⁶个细胞/mL的浓度悬浮细胞。
  
• 制备20mM NHS-生物素试剂溶液：在0.5mL水溶性有机溶剂如二甲基亚砜(DMSO)或二甲基甲酰胺(DMF)中溶解4～5mg试剂。
  
• 每mL细胞悬浮液加入100μL NHS-生物素试剂溶液(约2mM生物素试剂)。
  
• 反应混合物在室温下孵育30分钟。
  
• 向PBS中加100mM甘氨酸后洗涤细胞三次，淬灭并除去多余的生物素试剂和副产物。
  
• 根据研究方法的要求对生物素标记的细胞进行裂解或分析。

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